材料

窗体顶端 准备材料与实验方法 1.1载体与菌株 （1）载体：pMD18-T载体购于TaKaRa公司。pcDNA3.1+载体购于Invitrogen公司。其中pcDNA3.1+的载体结构如图所示  （2）大肠杆菌菌株（用于克隆）：DH5α，购于 TransGen 公司。  （3）细胞系：采用人羊膜上皮细胞（WISH 细胞），来源于本试验室的冻存细胞。

1.2 PCR新增产物的检测和回收  将5μL标准分子量的DNA Marker DL2000作为参考，所以首先需取1.5%的琼脂糖凝胶用来检验并测试PCR扩增所产生的物质，其次将5 μL的生成物质全部加入凝胶孔内。随后需要将凝胶孔内物质进行电泳，需要的电流是200mA，电压是200V，结束后应将凝胶孔内的成像结果进行观察并进行拍摄记录。此次实验需要在室内常温下进行，该实验方法对各种浓度回收中的琼脂糖凝胶60bp-20kb的DNA片段都有一定的实用。

琼脂糖凝胶回收：参考Omerga胶回收试剂盒说明书 1.3构建表达载体和酶切回收 1.3.1pMD18-T载体连接与转化 将回收的PCR产物连入pMD18-T载体上，根据说明书进行操作 1.3.2质粒的提取 连接pMD18-T，其中质粒小量的提取可以参考Omega公司的质粒小提试剂盒 1.3.3重组表达质粒的构建 将载体，即pMD18-T和pcDNA3.1+，进行双酶切，其中很关键的是该载体需要含有质粒。

1.3.4提取去内毒素和表达质粒的重组 参考Omega公司的Endo-free Plasmid Mini Kit II(D6950-01)的说明书进行。内毒素的提取和重组。

1.4细胞培养 （1）首先需将细胞进行复苏 （2）对细胞进行培养，培养的过程只需常规操作进行培养 （3）将培养后的细胞冻存即可 1.5细胞转染 此次实验在细胞培养之后需将细胞进行转染 转染操作参考：Life Technologies 公司的LipofectamineTM  3000和Invitrogen公司的RNAiMAX 1.6提取细胞总RNA 在提取细胞RNA的过程需参考 Omega 的 RNA 提取说明书。

1.7实时荧光定量分析 在提取RNA后，需要将其测定浓度，并将其进行电泳检测，目的是检测质量是否合格，合格状态应是提取后的RNA仅有两条带，分别是28S和18S，并且18S的亮度应是28S亮度的一半。随后进行反转录操作（参考依据：Thermo Scientific反转录试剂盒）。

1.8 Western Blot实验步骤 （1）首先提取蛋白 （2）使用SDS-PAGE试剂进行电泳  （3）将其进行转模 （4）观察抗原抗体发生免疫反应 1.9ELISA 使用17β-Estradiol EIA kit试剂盒对收集的细胞上清进行ELISA分析 1.10免疫组化过程 1.10.1石蜡切片的免疫组化实验步骤 （1）将石蜡切片并脱蜡至水 （2）进行抗原修复 （3）切断内源性过氧化物酶 （4）使血清或BSA处于封闭 （5）加入一抗 （6）加入二抗 （7）DAB显色 （8）将细胞核复染 （9）将封片进行脱水处理 （10）使用显微镜进行镜检，随后对图像数据收集分析。

1.11 活体实验的实施方案 （1）首先将试验分为5组，包括：PFT-μ 组、LPS 组、PFT-μ-LPS 组以及DMSO对照组和PBS对照组 注意：由于DMSO和PB分别属于PFT-μ和LPS的溶剂，所以实验中需要采用两个对照组 （2）将雄性鼠和雌性鼠放入同一个笼子后，第二天将带有阴道栓的雌鼠妊娠天数记录为0，随后将其随机分为组，每组放入6只 当雌鼠妊娠15天时，分别将它们进行DMSO、PFT-μ、LPS 和 PBS的注射。在妊娠 15 天时，将PFT-μ-LPS组，首先注射 PFT-μ，大约1 h过后再对其注射 LPS。两次的量分别为：DMSO: 100 μL; PFT-μ: 1 mg/只，浓度为 10 mg/mL 的 PFT-μ 注射 100 μL; LPS: 50 μg/只，浓度为0.5 mg/mL 的 LPS 注射 100 μL; PBS: 100 μL。  将雌鼠腹腔内注射各试剂，并在6h内第一只胎儿鼠分娩时，需要收集各组的胎膜。

1.12统计学分析 本实验通过建立试验组和对照组进行探究，并使用SPSS16.0和SAS进行单因素的方差进行分析同时带有显著性检验，产生的结果均已均值±标准误表示。其中差异显著使用*表示，即p＜0.05，差异极显著使用**表示，即p＜0.01 窗体底端

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